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OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS EMPLEANDO Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.


Categoría: Superior (Licenciatura)
Área de participación: Medio Ambiente

Equipo: OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS EMPLEANDO Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.

Miembros del equipo:
Vanessa Nieves Rodriguez
Daniela Martinez Vega
Brenda Andrea Tovar Rocha

Asesor: M en C. F.Jose Sanchez Enriquez

Escuela: Unidad de estudios superiores Tultitlán

Resumen

El etanol es un compuesto químico que se obtiene a partir de la fermentación de los azucares para que se pueda utilizar como combustible alterno, durante los últimos siglos el petróleo y sus derivados han creado en la humanidad una dependencia total.

Los materiales lignocelulósicos surgen como la fuente alternativa para la producción de bioetanol, sin embargo, por su compleja estructura es necesario realizar un adecuado pre-tratamiento e hidrólisis enzimática, para permitir liberar la mayor cantidad de azúcares, los cuales van a ser consumidos por microorganismos en procesos conocidos como fermentación, cuyo producto final es el etanol.

En este trabajo se pretende obtener bioetanol a partir de lirio acuático (Eichhornia crassipes), césped silvestre (Cynodon dactylon) y hojas de árbol de hule (Ficus elástica) debido a que su composición química contiene celulosa, el microorganismo que fermenta la glucosa en etanol no puede utilizarla directamente, esta investigación evaluara la capacidad de degradación de Trichoderma reesei para degradar la celulosa en azúcares fermentables.

Degradada la celulosa en glucosa se empleará Saccharomyces cerevisiae para obtener bioetanol, buscando las mejores condiciones óptimas de temperatura, y sustrato de glucosa para el mejor rendimiento de bioetanol.

Pregunta de Investigación

¿Es posible obtener bioetanol a partir de residuos lignocelulosicos empleando un método biológico?

Planteamiento del Problema

Durante los últimos siglos el petróleo y sus derivados han creado en la humanidad una dependencia total, ya que el 94% es utilizado para la locomoción y el resto para fabricar materiales y productos de uso diario como plásticos, látex, pinturas, fibras, etc. El descenso de las reservas de petróleo, y los problemas de contaminación ambiental como el efecto invernadero, han llevado a la búsqueda de materias primas renovables para la producción de biocombustibles.

Entre estas materias primas, los materiales lignocelulósicos surgen como la fuente alternativa para la producción de bioetanol, sin embargo, por su compleja estructura es necesario realizar un adecuado pre-tratamiento e hidrólisis enzimática, para permitir liberar la mayor cantidad de azúcares, los cuales van a ser consumidos por microorganismos en procesos conocidos como fermentación, cuyo producto final es el etanol.

El preocupante incremento por la seguridad de las reservas de petróleo y el impacto negativo de los combustibles sobre el ambiente, particularmente los gases de efecto invernadero, ha presionado a la sociedad a hallar fuentes alternativas renovables.

La fuente renovable más común en la actualidad es la producción de etanol de materiales amiláceos o de azúcares, sin embargo, estos presentan problemas de seguridad alimentaria, lo cual ha centrado la mirada de la comunidad científica en los materiales lignocelulósicos, cuyo reto actual es la optimización de los pre-tratamientos, la tecnología de fermentación, la ingeniería metabólica y la ingeniería enzimática.

Actualmente la obtención de los energéticos derivados del petróleo atraviesa una fuerte crisis debido a una disminución en sus reservas, por lo cual la aplicación de nuevas tecnologías dirigidas a generar combustibles a partir de materiales renovables como la lignocelulosa, y no de alimentos, representa una alternativa viable a la demanda energética mundial. En el material lignocelulósicos se dispone de una gran cantidad de azúcares fermentables, sin embargo, su utilización se puede ver impedida por la recalcitrancia intrínseca del material, una solución a este problema han sido los diversos métodos fisicoquímicos y biológicos que se han desarrollado para liberar los azúcares fermentables y obtener bioetanol. Algunas estrategias utilizando microorganismos como las levaduras se han enfocado en la obtención de etanol a partir de lignocelulosa mediante la expresión de enzimas celulolíticas y aprovechando la capacidad fermentadora de la levadura. En este proceso de sacarificación y fermentación simultánea se han obtenido cantidades y rendimientos significativos de etanol lo cual representa un punto de partida que conducirá al desarrollo de tecnologías encauzadas a satisfacer las necesidades energéticas en el futuro.

Antecedentes

En la actualidad, la biomasa lignocelulósica y en especial los subproductos Agro-industriales han dejado de ser productos de desecho-problema, para convertirse en materia prima potencial para diversos procesos tanto de tipo agrícola como industrial, siendo la producción de alcohol carburante uno de los más importantes.

En décadas recientes se ha investigado fuentes energéticas alternativas que sustituyan paulatinamente a los combustibles fósiles. Ahora, el interés por los biocombustibles, en especial para el sector transporte, se debe a cuatro factores:

  • Seguridad en el suministro de energía.
  • Disminución de las reservas de hidrocarburos.
  • Volatilidad del precio del petróleo.
  • Mitigación de los efectos del cambio climático.

 

Sin embargo, han sido y son muchos los limitantes que se han presentado en torno a la obtención de etanol a partir de este tipo de materiales, debido a su estructura lignocelulosa de compleja degradación. Por ello, han surgido diversidad de trabajos e investigaciones, que abarcan distintas problemáticas y proponen

alternativas de solución y aportes enormes que poco a poco han abierto el camino

hacia la explotación de la biomasa lignocelulósicos para este fin. Los procesos para la obtención de alcohol por fermentación dependen de la naturaleza de la materia prima. Los materiales con alto contenido de azúcares requieren, por lo general, poco o ningún tratamiento preliminar aparte de la dilución. En contraste, las materias primas amiláceas y lignocelulósicas deben ser hidrolizadas a azúcares fermentables antes de que actúen sobre ellas las levaduras. La biomasa lignocelulósica (por ejemplo, madera, residuos forestales y agrícolas, papel de desecho, residuos sólidos urbanos, etc.) requiere una transformación más drástica que involucra complejos procedimientos de pretratamiento e hidrólisis, que aumentan significativamente los costos de procesamiento. (Sánchez Riaño, A. Gutiérrez Morales, A.  Muñoz Hernández. y Rivera Barrero, 2010).

Las variaciones en la composición de la materia prima y en sus métodos de transformación dan lugar a múltiples variantes en la configuración del esquema tecnológico de obtención de bioetanol.

De lo anterior se infiere la importancia de la síntesis y el diseño de procesos que permitan la reducción de los costos de producción del alcohol, así como la disminución del impacto ambiental que causa su obtención industrial. (Eliana M. Cardona, 2012) Presenta una revisión sobre las variedades más comunes de pastos y forrajes en Colombia para analizar su potencial como materiales lignocelulósicos para la producción de combustibles como bioetanol y biobutanol cereales para su fermentación implica operaciones como la molienda y la conversión del almidón en glucosa mediante licuefacción y sacarificación. La biomasa lignocelulósica (por ejemplo, madera, residuos forestales y agrícolas, papel de desecho, residuos sólidos urbanos, etc.) requiere una transformación más drástica que involucra complejos procedimientos de pre tratamiento e hidrólisis, que aumentan significativamente los costos de procesamiento. Las variaciones en la composición de la materia prima y en sus métodos de transformación dan lugar a múltiples variantes en la configuración del esquema tecnológico de obtención de bioetanol. De lo anterior se infiere la importancia de la síntesis y el diseño de procesos que permitan la reducción de los costos de producción del alcohol, así como la disminución del impacto ambiental que causa su obtención industrial. (Eliana M. Cardona, 2012.) Presenta una revisión sobre las variedades más comunes de pastos y forrajes en Colombia para analizar su potencial como materiales lignocelulósicos para la producción de combustibles como bioetanol y biobutanol.

El lirio acuático (Eichhornia crassipes), considerado plaga en los canales del área Natural Protegida (ANP) de Xochimilco, es una de las plantas con mejor reproducción y tasa de crecimiento, por lo cual se extiende rápidamente y forma tapetes o esteras que constriñen a las plantas nativas sumergidas y flotantes en los cuerpos de agua (Harun, 2008), disminuye la entrada de luz y merma el oxígeno disuelto en el agua.

El lirio acuático está catalogado dentro de las plantas más productivas del mundo y es considerada una de las peores plagas acuáticas. Su densidad de crecimiento interfiere con la navegación, la recreación, la irrigación y la producción de energía. Algunas de las más grandes hidroeléctricas destinan gran cantidad de dinero y horas hombre para remover “Cambios en la composición del lirio acuático (Eichhornia crassipes) debidos a su grado de madurez y a su transformación biotecnológica” completamente esta planta y evitar así que pueda llegar a atascarse en las turbinas y provocar cortes en el suministro de energía. Por ejemplo, en la estación hidroeléctrica “Owen Fall” en Uganda, se ha reportado que los generadores y enfriadores de agua son continuamente dañados por la presencia de matas de lirio, lo que se traduce en la pérdida de gran cantidad de energía eléctrica para en el suministro a las áreas urbanas (Labrada,1996). Además, el bloqueo de los canales y ríos llega a provocar severas inundaciones (Malik, 2007) (Juarez Luna Gregorio, 2011)

El pasto bermuda (Cynodon dactylon) o agrarista denominado así por su rusticidad y resistencia al mal manejo, es un pasto que coloniza rápidamente el suelo donde se establece, pero a pesar de esta peculiaridad suele ser considerado una maleza, y es calificado como no deseable por su agresividad en el establecimiento y por no permitir el desarrollo de otras especies vegetales, ya que con la presencia de humedad (época húmeda) e independientemente de la fertilidad del suelo, su crecimiento y rebrote es más rápido que muchas especies vegetales nativas e inclusive a pastos de hábitos de crecimiento erecto (Silva, 2015).

En los últimos años por su producción de hemicelulosa esté pasto está siendo considerado como una alternativa para la producción de biocombustibles en comparación con otras especies de gramíneas tropicales (C4) de alta producción de biomasa (Haque, 2009) (Banka, 2015).

El Árbol de hule (Ficus elástica) puede alcanzar una altura de 50-60 m, con un tronco de 78 cm de circunferencia, que puede llegar a varios metros de diámetro, corto y grueso, a veces muy ramificado desde poca altura. Se caracteriza por tener una corteza grisácea, lisa, con ranuras horizontales.

 

 

Objetivo

Objetivo general:

Obtener bioetanol a partir de lirio acuático (Eichhornia crassipes) césped silvestre (Cynodon dactylon) y hojas de árbol de hule (Ficus elástica) empleando Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.

 

Objetivos específicos:

  • Obtener bioetanol por separado empleando cada uno de los sustratos lirio acuático, césped silvestre y hojas de árbol de hule y los microorganismos Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.
  • Cuantificar la cantidad de bioetanol obtenido de cada uno de los sustratos señalados con los microorganismos Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae
  • Determinar la pureza del bioetanol obtenido de cada uno de los sustratos indicados por refractometría.

Justificación

El crecimiento del lirio acuático en lagos como el de Xochimilco en la ciudad de México, el lago de Zumpango en el Estado de México y en Catemaco en Veracruz se presenta como una amenaza en virtud de que año con año se incrementa el crecimiento y extensión de esta planta considerada ya una plaga pues impide el crecimiento de flora y fauna de esos ecosistemas. Se pretende con esta investigación dar un uso a esta plaga de manera que sea utilizada como materia prima para la producción de bioetanol.

El césped silvestre si bien no es una plaga constituye un gran desecho al momento de realizar las podas en camellones del Estado de México y Ciudad de México, así como en los jardines de escuelas, universidades e instituciones del país de manera que puede utilizarse como materia prima para la obtención de bioetanol y así dar a este desecho un uso extra.

Aunque menos abundante en el Estado de México y Ciudad de México, las calles se tapizan de hojas de árboles-caducas en general y en particular del árbol de hule durante el otoño de tal manera que podrían emplearse estas hojas en la producción de bioetanol.

Es así como en este trabajo de investigación pretende obtener bioetanol a partir de los sustratos de lirio acuático, césped silvestre y hoja de árbol de hule debido a que son una fuente de celulosa y lignocelulosa muy grande que al ser transformada en azúcares simples se fermenta en etanol con relativa facilidad.

 

Hipótesis

Si Trichoderma Reesei degrada la celulosa del lirio acuático, del césped silvestre y de la hoja del árbol de hule en azúcares sencillos, entonces se podrá emplear a Saccharomyces cerevisiae para obtener bioetanol proveniente de sustratos no convencionales.

Método (materiales y procedimiento)

  • Recolección de lirio acuático del lago de Zumpango, Estado de México
  • Lavado y secado a  80°C  durante 24 horas del lirio recolectado (tallos y hojas)
  • Moler y tamizar por malla 60 el lirio seco
  • Pesar 1 kg del lirio seco y tamizado y adicionarle 1.5 litros de agua destilada, esterilizar a 120°C por 15 minutos y 15 libras de presión
  • Inocular la mezcla estéril anterior con Trichoderma reesei  e incubar por 4 días a temperatura ambiente (fermentación)
  • Trascurrido el tiempo de fermentación, tomar una alícuota de 50 ml del fermentado y realizar las pruebas de Tollens, Benedict, Fehling y Yodo-yodurada para verificar si se hidroliza la  celulosa con las enzimas producidas por Trichoderma reesei en azúcares.
  • Filtrar el resto del fermentado en condiciones asépticas
  • Inocular el filtrado con    e incubar  a 36°C por 8 días.
  • Filtrar y destilar el filtrado el cual contendrá bioetanol.
  • Determinar la pureza del bioetanol obtenido por refractometría utilizando el refractómetro de Abbe.
  • Proceder como en los pasos anteriores pero con Césped silvestre y hojas de árbol de hule.

 

 

Galería Método

Resultados

Galería Resultados

Discusión

Se hizo la recolección de hojas de árbol de hule, el lirio acuático y el césped.

       Se realizó la limpieza de las mismas, se llevaron a una esterilización en autoclave y posteriormente se secaron.

       Se pesaron 30 gr de cada una de las muestras, ya estériles y previamente deshidratadas. En este paso, se separaron las hojas del tallo de lirio acuático, para una mejor molienda.

       Se realizó la molienda de los mismos, con un poco de agua destilada.

       Se preparó el agar D.P, mismo que se llevó a ebullición (19.5 gr en 500 ml de agua destilada). Posteriormente se prepararon las cajas Petri con el medio de siembra. Se inoculo el Trichoderma Ressei y se dejó en incubación a temperatura ambiente por 5 días.

       Cinco días después, identificamos el hongo que había crecido en las cajas con el agar D.P, aquí se utilizó el método de Tinción de Gram.  Notamos, que nuestro medio se había contaminado, habían crecido bacterias y bacilos en las cajas. Por lo que se volvió a preparar el agar, pero ahora en lugar de utilizar A.D.P se utilizó Dextrosa Sabouraudse, prepararon 32.5 gr en 500 ml de agua destilada, se llevó a esterilización en autoclave y finalmente se volvió a inocular el Trichoderma Ressei, que ahora se fue a la incubadora a 38° por 3 días.

       Tres días después se identificó por tinción de Gram el hongo, que ahora si fue Trichoderma ressei.

       Se procedió a inocularlo dentro de los matraces Erlen Meyer de 500 ml, que contenían el césped, las hojas de lirio, el tallo del mismo (previamente esterilizado, seco y molido). Se dejó reposar por tres días más.

       Pasados esos días, se hizo la identificación de azucares, haciendo la prueba de Fehling. Se preparó para 50 ml de reactivo: 1.75 gr de sulfato de cobre cristalizado, 7.5 gr de tartrato de sodio y potasio y 5 gr de hidróxido de sodio al 40%.

La prueba, dio positiva a azúcar.

Esto fue el trabajo realizado hasta la fecha, debido a que el Trichoderma ressei si degrado las paredes de celulosa y lignina, se procederá a la filtración del contenido de los matraces, este líquido se inoculará con Saccharomyces cerevisiae, para que fermente el azúcar en etanol.

 

Conclusiones

El hongo Trichoderma reesei , si degrada a la celulosa de los residuos lignocelulósicos.

La cantidad de azúcar obtenida es de 693.1 mg a partir de 4 g de cada sustrato.

La cantidad de bioetanol producida fue de 11 ml  con una pureza del 31%.

Se demostró que el sistema Trichoderma reesei- Saccharomyces cerevisiae permite producir etanol a partir de la celulosa de pasto, lirio acuático y hoja de árbol de hule.

Bibliografía

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OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS EMPLEANDO Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.


OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS EMPLEANDO Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae.

Summary

Ethanol is a chemical compound that is obtained from the fermentation of sugars so that it can be used as an alternative fuel, during the last centuries oil and its derivatives have created in humanity a total dependence.

Lignocellulosic materials emerge as the alternative source for the production of bioethanol, however, due to its complex structure, it is necessary to carry out an adequate pre-treatment and enzymatic hydrolysis, in order to release the greatest amount of sugars, which will be consumed by microorganisms in processes known as fermentation, whose final product is ethanol.

This work aims to obtain bioethanol from water lily (Eichhornia crassipes), wild grass (Cynodon dactylon) and rubber tree leaves (Ficus elastica) because its chemical composition contains cellulose, the microorganism that ferments glucose in ethanol can not use it directly, this research will evaluate the degradation capacity of Trichoderma reesei to degrade cellulose into fermentable sugars.

Degradated cellulose in glucose will be used Saccharomyces cerevisiae to obtain bioethanol, looking for the best optimal conditions of temperature, and glucose substrate for the best yield of bioethanol.

Research Question

Problem approach

Background

Objective

Justification

Hypothesis

Method (materials and procedure)

Results

Discussion

Conclusions

Bibliography