Equipo [RISEV] Evelin Mendez Romero[Biol.1], Iris Gonzalez Rosales[Biol.1]
El proyecto “RISEV” Extracción del aceite de semilla de calabaza (Cucúrbita sp).Para la desparasitación en nematodos caninos ovinos y de vida libre se centra en evaluar el potencial del aceite de semilla de calabaza como alternativa natural contra nematodos gastrointestinales y en una posible alternativa en respuesta a la resistencia generada por parásitos a la ivermectina utilizada principalmente para la erradicación de dichos, los análisis GC-MS revelaron dieciséis componentes fitoquímicos principales en el aceite, muchos asociados con propiedades bioactivas. Se identificaron bandas espectrales relacionadas con enlaces O-H, C-H y C=O, vinculadas a triglicéridos y ácidos grasos, confirmando la composición bioquímica del aceite. Los bioensayos con larvas L3 de Panagrellus redivivus mostraron poco efecto letal del extracto, calculado en función de la proporción de larvas muertas en 24 horas, lo que indica un impacto significativo en la viabilidad del parásito.
En el ámbito molecular, se realizaron análisis de expresión génica mediante RT-PCR en tiempo real utilizando larvas L3 de Haemochus contortus , aplicando el método comparativo ΔΔCt ,se emplearon genes antioxidantes, junto con un gen constitutivo. Los datos se procesaron en la plataforma GeneGlobe y se evaluaron estadísticamente con la prueba t de Student, estableciendo un nivel de significancia de 0.05, en conjunto, los resultados respaldan que el aceite de semilla de calabaza posee compuestos con actividad antihelmíntica, representando una alternativa sustentable y natural para la desparasitación en nematodos ovino, caninos y de vida libre.
The “RISEV” project: Extraction of pumpkin seed oil (Cucúrbita sp).This study focuses on evaluating the potential of pumpkin seed oil as a natural alternative for the control of gastrointestinal nematodes in dogs, sheep, and other free-living animals. The research aims to explore its efficacy against these parasites, particularly in light of the growing resistance to ivermectin, a commonly used anthelmintic. GC-MS analysis revealed sixteen major phytochemical components in the oil, many of which are known for their bioactive properties. Spectral bands corresponding to O-H, C-H, and C=O bonds, characteristic of triglycerides and fatty acids, were identified, confirming the biochemical composition of the oil.Bioassays using L3 larvae of Panagrellus redivivus showed little lethal effect of the extract, as measured by the percentage of dead larvae after 24 hours, indicating a significant impact on parasite viability.In the molecular study, gene expression analysis was performed using real-time RT-PCR with L3 larvae of Haemonchus contortus, applying the comparative ΔΔCt method. Antioxidant genes were used, along with a housekeeping gene.and they were statistically evaluated using the test t de Student,with a significance level of 0.05, the results collectively support the finding that pumpkin seed oil contains compounds with anthelmintic activity, representing a sustainable and natural alternative for the control of parasitic nematodes in sheep, dogs, and free-living animals.
Nopa RISEV tekitl kiixtomayaya nopa aceite tlen xinachtli calabaza kej se alternativa tlen tlauel kuali tlen nopa nematodos tlen amo kiijiyouiaj ivermectina. Nopa tlatemolistli tlen químicos uan moleculares kinextik compuestos bioactivos ika actividad anthelmintica, tlen kikualankaitaj nopa larvas uan nopa expresión genética, tlen kinextia se opción sostenible para nopa desparasitación tlen tlapialmej.
Las enfermedades parasitarias en animales representan un problema sanitario y económico importante los fármacos sintéticos actuales como la ivermectina han generado resistencia y efectos secundarios por ello surge la necesidad de buscar alternativas naturales.
Las enfermedades parasitarias en caninos representan un problema sanitario relevante, ya que afectan tanto la salud animal como la calidad de vida de los dueños y la comunidad en general. Los tratamientos convencionales se basan principalmente en fármacos antihelmínticos sintéticos; sin embargo, el uso constante de estos productos ha generado resistencia en parásitos como Haemonchus contortus, Panagrellus redivivus , Toxocara canis, además de efectos secundarios y repercusiones ambientales. Ante esta situación, surge la necesidad de buscar alternativas naturales, seguras y sostenibles. Las semillas de calabaza (Cucurbita sp.) han sido utilizadas tradicionalmente por sus propiedades antihelmínticas, antioxidantes y antiinflamatorias. Estudios fitoquímicos, como el análisis mediante GC-MS, han identificado compuestos bioactivos que pueden interferir en procesos vitales de los nematodos, provocando estrés oxidativo y afectando su viabilidad.
Los nematodos gastrointestinales de ovinos, caninos y de vida libre constituyen una de las principales causas de deterioro en el estado de salud de sus huésped,Estas enfermedades no solo afectan el bienestar animal, sino que también representan un riesgo para la salud pública debido a su carácter zoonótico, El tratamiento más común frente a nematodos gastrointestinales, ha sido el uso de antihelmínticos sintéticos. Sin embargo, la administración frecuente de estos fármacos ha provocado la aparición de cepas resistentes, reduciendo su eficacia y generando la necesidad de aplicar dosis más altas o combinaciones de medicamentos, lo que aumenta los costos y los posibles efectos adversos en los animales En este contexto, las semillas de calabaza (Cucurbita sp.), reconocidas tradicionalmente por sus propiedades medicinales, se perfilan como una opción prometedora. El aceite extraído de ellas contiene compuestos fitoquímicos con actividad biológica capaz de inducir estrés oxidativo en los parásitos, afectando procesos enzimáticos vitales y reduciendo su supervivencia.
Determinar el efecto antihelmíntico del aceite esencial de semilla de calabaza (Cucurbita sp.) en nematodos de caninos, ovinos y de vida libre, así como el acercamiento a su posible mecanismo de acción.
El control de parásitos gastrointestinales en animales domésticos, especialmente en caninos, se ha basado históricamente en el uso de antihelmínticos sintéticos como benzimidazoles, imidazotiazoles y lactonas macrocíclicas. No obstante, la exposición repetida a estos compuestos ha provocado la aparición de resistencia parasitaria en especies como Haemonchus contortus, reduciendo su eficacia y comprometiendo la salud animal. Este fenómeno se ha documentado ampliamente en la literatura (Tizard, 2009; Motavallihaghi et al., 2022).
Los mecanismos propuestos incluyen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), que provocan alteraciones en proteínas del citoesqueleto, membranas celulares y enzimas antioxidantes, tales como superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). Estos cambios afectan la viabilidad y capacidad reproductiva de los parásitos (Chiumiento et al., 2009; Henkle et al., 2001).
Se realizó un proceso de extracción por prensado en frio en el cual se extrajo la semilla de calabaza para un proceso de lavado, posteriormente se secaron en un horno de secado durante 6 hr a 50°C posteriormente se removieron las cascaras de las semillas para su prensado y obtención del aceite
Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC)
Después de realizar la extracción del aceite de semilla de calabaza se comenzó con la caracterización espectroscópicamente de dicho aceite con ayuda de UPLC a condiciones de 2 mL de extracto filtrado 0.2 micras y 2 mL de hexano con ayuda de la fase móvil la cual se realizó con ácido fórmico 1% 45:55 v/v acetonitrilo proporción con un tiempo de análisis de 45 min y una velocidad de 0.3 ml/min en columna ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18 1.7µm en dicho análisis se identificaron terpenos en tiempo de retención de 4.378 min.(Figura1)
2.2 CROMATOGRAFÍA CAPA FINA
Con la presencia de Terpenos en el aceite de semilla de calabaza proseguimos a una cromatografía en capa fina con ayuda de los reactivos Diclorometano-Metanol en dicha cromatografía se observó que los componentes del aceite al eluir de manera eficiente a concentraciones Diclorometano:Metanol (8:2) (Figura 2.)
Diclorometano:Metanol(5:5) (Figura 2.)
De acuerdo a .las cromatografías realizadas, se sugiere la presencia de triglicéridos y ácidos grasos por lo que para tener una mejor caracterización se realizó un prueba en un espectroscopia por infrarrojo-NIR con las siguientes longitudes de onda.
4.1.DILUCIÓN DEL ACEITE CON UN MEDIO DISPERSANTE CON PVP 30
Derivado de la naturaleza del extracto de semilla de calabaza es un aceite muy denso por lo que se tuvo que realizar una dispersión utilizando PVP (polivinilpirrolidona-K30),ayuda a mejorar la biodisponibilidad de ciertos principios activos al aumentar su solubilidad en agua interaccionar con la solución.
4.1. ANÁLISIS IN VITRO EN PANAGRELLUS REDIVIVUS
Una vez que en el aceite fue demostrada la presencia de ácidos grasos, triglicéridos y terpenos se optó por montar una placa para ensayos in vitro en el cual cada pozo se agregaron 100 larvas L3 de Panagrellus redivivus con controles positivos y negativos (Ivermectina y agua), algunos pozos contenían larvas con el extracto de semilla de calabaza y agua destilada, dejar actuar 24 hr y posteriormente cuantificar y saber la letalidad que se generó.(Figura 10.)
5.1. EXTRACCIÓN DEL ARN EN LARVAS HAEMONCHUS CONTORTUS
Al obtener baja efectividad en los bioensayos in vitro, hipotéticamente por la baja solubilidad del aceite en contacto con las larvas mencionadas. Se decidió realizar pruebas moleculares con la extracción de ARN en larva de L3 para someterlo a una prueba PCR tiempo real.
Desarrollándolo con los siguientes pasos: Desenvainar larvas de Haemonchus contortus L3 para posteriormente agregar trizol en un tubo eppendorf, luego se congelar en nitrógeno líquido, posteriormente macerar agregando cloroformo y centrifugar para congelar nuevamente en nitrógeno líquido y pasar al congelador por 60 min. Posteriormente centrifugar y retirar en otros tubos la fase acuosa y el sobrenadante obtenido (Figura 13.)
5.2.PCR EN TIEMPO REAL
Utilizando el ARN extraído de Haemochus contortus , aplicando el método comparativo ΔΔCt ,se emplearon genes antioxidantes, junto con un gen constitutivo. Los datos se procesaron en la plataforma GeneGlobe y se evaluaron estadísticamente con la prueba t de Student, estableciendo un nivel de significancia de 0.05.
El presente estudio permitió evaluar el efecto antihelmíntico del aceite esencial extraído de semillas de calabaza (Cucúrbita sp.) sobre nematodos de interés veterinario y de vida libre, así como aproximarse a su posible mecanismo de acción. Se logró cumplir con los objetivos planteados mediante un enfoque multidisciplinario que integró análisis químico, formulación farmacéutica, bioensayos nematicidas y estudios moleculares. En conjunto, los resultados sugieren que el aceite esencial de semilla de calabaza posee compuestos con potencial actividad antihelmíntica, especialmente a nivel molecular, aunque su efectividad biológica podría depender de la forma de contacto y formulación. Estos hallazgos abren la posibilidad de desarrollar alternativas naturales para el control de nematodos, con base en extractos vegetales, y destacan la necesidad de estudios adicionales para optimizar su eficacia en condiciones in vivo.
