Resumen

Las células son la unidad básica de la vida y construyen todos los seres vivos, el ADN controla todo lo que sucede en la célula. El ácido desoxirribonucleico o ADN, es la molécula que contiene instrucciones que dirigen las actividades de las células y en última instancia del cuerpo. Este proyecto demostrará cómo el ADN de las fresas puede ser aislado con materiales comunes y sencillos. Los seres humanos tienen dos copias de cada cromosoma (genoma diploide). Un cromosoma es un paquete organizado de ADN que se encuentra en el núcleo de la célula. Las fresas tienen enormes genomas y hasta ocho copias de cada cromosoma (genoma octoploide). La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice y está constituido por 4 componentes básicos llamados adenina, guanina, citosina y timina. Está investigación servirá  para informar a la población  sobre la importancia que tiene el ADN en el organismo y a partir del conocimiento de su estructura saber que existen diferentes enfermedades y poder tomar medidas preventivas y curativas.

Pregunta de Investigación

Planteamiento del Problema

Los trabajos que se realizan para entender el ADN y su aplicación, son muy complejos y especializados, sin embargo en nuestra vida diaria escuchamos hablar todo el tiempo del ADN, por ejemplo en las noticias o en las películas, está problemática de entender qué es el ADN, me llevó a investigar para saber como aíslan los científicos el ADN para estudiarlo. Descubrí que existe un experimento sencillo que permite aislar el ADN de diferentes organismos, de los cuales, en este caso se escogieron las fresas por la gran cantidad de ADN que contienen.

Antecedentes

Esta actividad de extracción de ADN produce una gran cantidad de ADN que se puede ver a simple vista, es una actividad relativamente sencilla, pero que constituye la base de las técnicas que utilizan se utilizan actualmente en biotecnología.

El ADN es el material genético de los organismos, su nombre completo es ácido desoxirribonucleico. Una subunidad de ADN se conoce como nucleótido, consiste de una base nitrogenada, un azúcar y un grupo fosfato. Cientos de miles de nucleótidos se unen dando lugar a una cadena polimérica, y dos cadenas de nucleótidos se entrelazan por enlaces débiles intermoleculares, de manera que forman una doble hélice para construir la molécula completa de ADN. Esta sustancia está contenida en los cromosomas presentes dentro del núcleo celular.

La secuencia de las subunidades del ADN determina las características de cada organismo. Se puede extraer ADN con los tejidos de un organismo con un procedimiento muy simple y económico como el que se propone en este experimento. (Fuente: Catalâ, Rosa María. “Extracción del ADN del kiwi”. Revista ¿Cómo ves? DGDC UNAM. Guía del maestro No. 37. Edición especial sobre las ciencias del genoma)

El material que escogimos para aislar el ADN fueron las fresas maduras debido a que producen enzimas (pectinasas y celulasas), que son sustancias químicas que ayudan en la descomposición de las paredes celulares (Fuente: Entrevista personal con expertos del IBT-UNAM)

Las fresas tienen enormes genomas. Los seres humanos tienen dos copias de cada cromosoma (genoma diploide). Un cromosoma es un paquete organizado de ADN que se encuentra en el núcleo de la célula. Las fresas tienen hasta ocho copias de cada cromosoma (genoma octoploide). (Fuente: Entrevista personal con expertos del IBT-UNAM)

El procedimiento utilizado en esta actividad tiene los mismos principios básicos de métodos más complejos de extracción de ADN en laboratorios avanzados. (Fuente: Catalâ, Rosa María. “Extracción del ADN del kiwi”. Revista ¿Cómo ves? DGDC UNAM. Guía del maestro No. 37. Edición especial sobre las ciencias del genoma)

El ADN es el material genético de los organismos vivos y de casi todos los virus. Esta molécula fue descubierta en el núcleo de la célula por F. Miesher en 1869 y desde los años cuarenta, O. Avery y sus colaboradores descubrieron que el material genético está formado de la molécula más bella, la doble hélice, el ADN. En la actualidad la biotecnología ha desarrollado variedad de técnicas para entender con mayor profundidad, las estructuras, funciones, mecánicas, etc. de los sistemas vivos. Estas herramientas se utilizan de manera rutinaria para desarrollar una  amplia variedad de estudios genéticos. En ellos, el primer paso es aislar el ADN, aunque existen diferente métodos para hacerlo, comparte el hecho de que la molécula se encuentra dentro de estructuras membranosas y asociada a proteínas por lo que se requieren usar sustancias adecuadas para obtenerlo lo más puro posible. (Fuente: Dávila C., Ma. Elena. Práctica de laboratorio. Biología I. Colegio de Ciencias y Humanidades UNAM, plantel Naucalpan. 2003)

En 1953 Watson y Crick descubrieron la estructura de la doble hélice del ADN. “Se trata de una estructura simétrica y armoniosa, que impresiona con su sencillez y complejidad”. (Fuente: Bonfil O., Martín. “50 años de la doble hélice. La molécula más bella del mundo”. Revista ¿Cómo ves? DGDC UNAM. No. 53 Abril, 2003 pág. 10-16)

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos (miles e incluso millones de ellos) unidas entre sí formando una doble hélice.

Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina –A-, guanina –G-, timina –T- o citosina –C-). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal (Como la que se observa en la fotografía 1 y la figura 1).

Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite (Sambrook et al. 1989). Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente (Nasón 1965, Travaglini 1973, Sambrook et al. 1989, Sinden 1994).

A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas  positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina (Guinn 1966, Dundass et al. 2008). La membrana está insertada dentro de un microtubo de polipropileno y las microésferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora.

Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a ésta durante la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz.

Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN (Qiagen 2005, Invitrogen 2005). Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son muy eficientes (Qiagen 2005, Invitrogen 2005).

La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado de conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo para obtener resultados. Independientemente del método seleccionado es recomendable encontrar un equilibrio entre pureza y rendimiento de acuerdo a la aplicación posterior.

Objetivo

Efectuar la técnica de separación de ADN de las fresas, para observar cada uno de los pasos y documentarlos a través de fotografías.

Mostrar la presencia de ADN  (indirectamente) en las fresas, a partir de una técnica que utiliza materiales que comúnmente encontramos en casa.

Comprender que está técnica es solo el inicio de otras que se aplican en el ámbito científico para resolver problemas de genética y el mejoramiento de razas.

Justificación

Está investigación servirá  para:

• Divulgar importancia que tiene el ADN en los organismos vivos y a partir del conocimiento de su estructura mostrar que existen mucha aplicaciones.
  • Identificar factores que hacen más susceptibles a los seres humanos y animales a ciertas enfermedades y con ello tomar medidas preventivas y curativas.
  • Identificar factores que hacen más resistentes a las plantas a ciertas enfermedades, o a las sequias.
  • Identificar restos humanos en actividades forenses o antropológicas
  • Identificar especies de plantas y animales para determinar si corresponden a las ya conocidas o son nuevos descubrimientos.
  • A través de un cada vez más sofisticado conocimiento del ADN se abren posibilidades en diversos temas de alimentación, salud, ecología, biología, zoología, etc. Incluso hasta llegar el punto de preguntarnos si hoy ¿La extinción es para siempre? Ya que cada vez hay más posibilidades de recuperar especies que creíamos nunca volver a ver sobre la Tierra (Las desextinciones: http://www.cienciorama.unam.mx/a/pdf/302_cienciorama.pdf)

Proponer que esta investigación se utilice en el laboratorio escolar del Colegio para que los alumnos aprendan una forma sencilla de separar el ADN contenido en las fresas.

Hipótesis

Si logro separar el ADN de las fresas a partir de una técnica sencilla, entonces podré demostrar la funcionalidad de la técnica para su separación usando materiales comunes, así como su fácil observación a simple vista.

Método (materiales y procedimiento)

Materiales

1 Bolsa de plástico resellable o un mortero

Fresas frescas 150g

Detergente líquido para trastes 10 ml

Sal 5g

Agua 125 ml

2 recipientes de 250 ml  (uno será utilizada para el aparato de filtrado que se indica a continuación)

Aparatos de filtrado: filtro de café y  recipiente de 250 ml

Alcohol 90 % enfriado con hielo 30ml (se agrega la misma cantidad que se obtiene del filtrado de fresa).

1 palito de paleta de madera o de plástico para agitar.

Procedimiento:

1. Retirar las hojas verdes en la fresa que no se han eliminado todavía.

2. Colocar las fresas en la bolsa de plástico resellable o en un mortero y suavemente aplastar durante dos minutos.

Aplastar completamente la fresa. Esto empieza a romper las células y liberar el ADN.

3. Colocar en un recipiente el líquido para extracción de ADN: mezclar 10 ml de detergente, 5g de sal y  125 ml de agua.

4. Agregar 30ml de líquido de extracción de ADN en mortero con la fresa. Esto producirá el rompimiento de las células.

5. Vuelva a sellar la bolsa o utilice el mismo mortero y aplaste suavemente durante un minuto (Evite hacer demasiadas burbujas de jabón).

6. Coloque el filtro de café dentro de un embudo.

7. Abra la bolsa y vierta el líquido de fresa en el filtro. Puede enrollar el filtro justo por encima del líquido y apretar suavemente el líquido remanente hacia el recipiente.

8. A continuación, se vierte en el recipiente la misma cantidad de alcohol que el líquido de fresa. No mezclar o revolver. El ADN se aislará del resto del material contenido en las células de la fresa.

9. A los pocos segundos, se observa el desarrollo de una sustancia blanca turbia (ADN) en la parte superior, por encima de la capa de extracto de fresas.

10. Incline el recipiente y recoja el ADN utilizando un agitador de plástico o palo de madera.

Galería Método

Resultados

1. A los pocos segundos, se observa el desarrollo de una sustancia blanca turbia (ADN) en la parte superior, por encima de la capa de extracto de fresas.

2. Incline el recipiente y recoja el ADN utilizando un agitador de plástico o palo de madera.

Galería Resultados

Discusión

En mi visita al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (IBT-UNAM) aprendí acerca de la extracción del ADN de las fresas y de esta manera fue posible continuar con mi trabajo de investigación y adecuar la técnica  a los instrumentos que tenía disponibles para ello.

El conocimiento acerca del ADN que fue descubierto apenas hace poco más de 60 años nos permite investigar acerca de enfermedades, plagas, especies animales y vegetales, así como sus características que las hacen más o menos resistentes a sequías, nutrientes, bacterias, etc.

Por ejemplo, un investigador me mostró como manipulan el ADN de la raíz de una planta de frijol para determinar que parte del mismo es la responsable de atraer una bacteria que vive en el suelo y que es muy importante para fijar el nitrógeno a dicha raíz, mismo que es un nutriente esencial y sería muy deseable que todas las raíces atrajeran esa bacteria para que las plantas de frijol crezcan más grandes y sanas.

El ADN de las fresas tiene 4 veces más copias que el humano, es octoploide por lo cual es mucho más fácil de separar y observar a simple vista. El jabón líquido que utilizamos, rompe las células exponiendo al ADN, la sal diluida en agua forma iones que rodean a las moléculas de ADN y neutralizan su carga negativa y el alcohol sirve para aislar el ADN del resto del material (Extrae tu propio ADN, Fundación UNAM, 2013).

La fase experimental muestra con fotografías cada paso para aislar el ADN. Y en las numeradas de la 13 a la 16 se observa con claridad una nata blanca que flota y se ha separado del resto de la mezcla, dicho material corresponde al ADN que se pretendía aislar.

Conclusiones

Esta actividad de extracción tal como lo habíamos pensado, produjo una gran cantidad de ADN que se puede ver a simple vista. Es mucho más eficaz que la extracción de ADN de cualquier otra fuente, porque las fresas son suaves y fáciles de romper y contienen 8 copias de cadenas de ADN diferentes es decir que son octoploides.

Además, fresas maduras producen enzimas (pectinasas y celulasas), que son sustancias químicas que ayudan en la descomposición de las paredes celulares.

Con la técnica utilizada es posible validar la hipótesis que establecimos al iniciar el trabajo, es posible aislar el ADN de las fresas y observarlo a simple vista.

Existen técnicas cada vez más sofisticadas para facilitar y hacer más eficiente el proceso de extracción del ADN pero la base de ellas es un sencillo método como el que muestro en mi trabajo y el cual funciona perfectamente para cumplir los objetivos de esta investigación.

Esta metodología para aislar el ADN se puede utilizar como una práctica del laboratorio escolar para que los alumnos de nivel primaria.

Bibliografía

1. http://www.conacytprensa.mx/index.php/vocabulario/6968-secuenciacion-de-adn
2. http://www.comoves.unam.mx/numeros/articulo/146/diez-anos-del-genoma-humano-promesas-rotas-y-hallazgos-inesperados
3. http://www.cienciorama.unam.mx/a/pdf/302_cienciorama.pdf “Las desextinciones”.
4. Bonfil O., Martín. “50 años de la doble hélice. La molécula más bella del mundo”. ¿Cómo ves? DGDC UNAM. No. 53 Abril, 2003 pp. 10-16
5. Strathern, Paul. “Crick, Watson y el ADN”. Siglo XXI de España, 199. 112 pp.
6. How to Extract DNA from a strawberry. Documento sin referencias, proporcionado por investigadores del IBT-UNAM, Cuernavaca, Morelos.
7. Catalâ, Rosa María. “Extracción del ADN del kiwi”. Revista ¿Cómo ves? DGDC UNAM. Guía del maestro No. 37. Edición especial sobre las ciencias del genoma.http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/37/guiadelmaestro_37.pdf
8. Piro, Oscar E. “Breve historia del ADN, su estructura y su función”. Departamento de Física e Instituto IFLP (CONICET), FCE, UNLP, CC 67, (1900) La Plata, Argentina.
9. Alejo V., Laura P. Et.al. “Extracción y purificación de ADN”. Unidad de Biotecnologia y Prototipos. Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Avenida de los Barrios Numero 1, Colonia Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado deMexico, Mexico C.P. 54090. Correo-e: [email protected].

Departamento de Biologia. Universidad Autonoma Metropolitana, Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Delegacion Iztapalapa, Mexico D.F., Mexico C.P. 09340. Apartado postal 55532. Teléfono: 5804-6456. Fax: 58044688.

Correo-e: [email protected].

Correo-e: [email protected].

10. Bolivar Z., Francisco G. Compilador y Editor. “Fundamentos y casos exitosos de la biotecnología moderna” 2ª. ed. El Colegio Nacional. México 2007. pp. 736
11. Dávila C., Ma. Elena. Práctica de laboratorio. Biología I. Colegio de Ciencias y Humanidades UNAM, plantel Naucalpan. 2003

Summary

Research Question

Problem approach

Background

Objective

Justification

Hypothesis

Method (materials and procedure)

Method Gallery

Results

Results Gallery

Discussion

Conclusions

Bibliography